Desinfektion und steriles Arbeiten

Allgemein

In diesem Abschnitt geht es vermutlich um das schwierigste, aber ebenso wohl auch wichtigste Thema bei der Planktonzucht als Futterquelle: die Desinfektion des Equipments und das keimfreie Arbeiten mit den Kulturen.

 

Nichts ist so häufig schuld an dem Zusammenbruch einer Kultur, wie das einschleppen von Bakterien, Fremdalgen oder (anderem) Zooplankton. Zooplankton frisst sich sogar innerhalb weniger Stunden oder Tage durch eine komplette Phytoplanktonkultur und kann auch andere Zooplankton-Arten schnell oder langsam verdrängen oder gar fressen. Manche Bakterien (Krankheitserreger) und Fremdalgen können aber auch dem Zooplankton gefährlich werden, vermindern dessen Reproduktionsrate oder gelangen mit dem Zooplankton (z.B. über Siebe oder das Kulturwasser) in die Aufzuchtbecken und sorgen dort für einen Totalausfall oder massive Verluste bei den Jungtieren. Dabei reagieren alle Arten unterschiedlich auf Kontaminationen und Eindringlinge. Arten wie z.B. Isochrysis, Tetraselmis, Rhodomonas u.v.a. sind da z.B. viel anfälliger als z.B. Nannochloropsis oder Synechococcus. 

Leider sind axenische Kulturen (Reinkultur eines einzigen Organismus) nur selten von Universitäten oder Laboratorien der Medizinforschung, für teures Geld zu bekommen. Planktonkulturen, die jedoch für die Aquakultur/Fischzucht gedacht sind, werden hingegen niemals gänzlich keimfrei angeboten. Zumindest haben wir bislang noch keine lebende, axenische Kultur zu diesem Zweck erhalten. Sollten Sie weiterführende Informationen haben, wären wir Ihnen überaus dankbar und würden uns auch erkenntlich zeigen, wenn Sie diese Informationen mit uns und unseren Kunden teilen.

Aus diesem Grund kontrollieren wir unsere Kulturen stets selbst und isolieren ggf. die Zellen bzw. Individuen, um möglichst reine, auf jeden Fall stabile, Kulturen zu produzieren.

 

Deswegen ist Ihr weiteres, steriles Arbeiten essentiell, damit Sie vollen Erfolg bei der Plankton- und Fischzucht haben.

Folgende Punkte sollten Sie dabei stets beachten:

  1. Der Reaktor bzw. das Zuchtgefäß wurde gründlich gereinigt und desinfiziert.
  2. Alle Schläuche, Röhrchen, Spritzen, Kanülen und Filter sind steril oder wurden desinfiziert.
  3. Der Dünger ist keimfrei und/oder wird über einen sterilen 0,2µm-Spritzenfilter aufgezogen.
  4. Das angemischte Salzwasser wurde desinfiziert (wird im nächsten Abschnitt genauer erklärt).
  5. Der Deckel des Reaktors liegt gänzlich auf, die einströmende Luft (in den Reaktor) wird über einen Luftfilter gereinigt und die ausströmende Luft (aus dem Reaktor) wird durch Watte oder einen Filter geführt, ohne das Staub, Bakterien oder Fremdalgen in den Reaktor gelangen können.
  6. Nach dem "Ernten"/Abschöpfen, wird der Hahn des Reaktors mit einem sauberen Küchentuch abgetrocknet und oberflächlich desinfiziert.

Reaktoren und Zuchtgefäße desinfizieren

GANZ WICHTIG: BENUTZEN SIE IMMER HANDSCHUHE UND SORGEN SIE FÜR AUSREICHENDE BELÜFTUNG IM RAUM! DAS BEFOLGEN DIESER ANLEITUNG GESCHIEHT AUF EIGENE GEFAHR.

 

Bei der Reinigung und Desinfektion der Reaktoren und Zuchtgefäße ist die Bauweise ausschlaggebend. Ecken, Kanten oder Rillen sind ein perfekter Ort für Bakterien, um sich festzusetzen und von dort aus zu expandieren. Von daher ist hier besonders drauf zu achten, dass Bakterien möglichst keine Siedlungsflächen geboten werden. Der Reaktor bzw. das Zuchtgefäß, sollte also von innen absolut glatt und ohne Ecken/Kanten sein. 

Ebenso sollte die obere Öffnung (der Einlass) nicht zu klein sein, sodass man mit der Hand hindurch kommt und den Boden des Gefäßes gut erreicht. Ein Deckel, der die Kultur vor groben Schmutzpartikeln und einem Bombardement von Bakterien und Fremdalgen bewahrt, ist unabdingbar und von höchster Priorität, sofern man die Kultur länger laufen lassen (Semi-Batch-Kultur) möchte und diese nicht für den einmaligen Durchlauf (Batch-Kultur) gedacht ist.

  • Zuallererst wird das Gefäß mit einem weichen Schwamm, warmen Wasser und etwas Spülmittel sehr gründlich gereinigt.
  • Sollte der Reaktor/das Gefäß bereits benutzt worden sein, ist es ratsam die Kalkablagerungen mithilfe von Zitronensäure zu entfernen. Dazu wird der Reaktor mit warmen Zitronensäure-Wasser, bis oben hin aufgefüllt und für einige Stunden stehen gelassen damit es einwirken kann. Im Anschluss abspülen und Kalkreste entfernen.
  • Im nächsten Schritt wird der Reaktor/das Gefäß bis zum oberen Rand mit Wasser befüllt. Hinzu kommen 5ml Natriumhypochlorid (Chlor) pro 1 Liter Wasser (Osmose- bzw. destilliertes Wasser), welches gut verrührt, über mehrere Stunden einwirken muss (min. 8h). Beispiel: Reaktor Bruttofüllmenge 14L (14L x 5ml = 70ml Natriumhypochlorid)
  • Zur Neutralisierung (oder besser gesagt, zum binden) des Natriumhypochlorids nutzt man Natriumthiosulfat (Fixiersalz). Dazu erstellen wir zuerst eine Lauge, bestehend aus 125g Natriumthiosulfat, welches in 500ml (keimfreien) Wasser gut aufgelöst wird. Von dieser Lauge geben wir 2ml je 1L Chlorwasser (Natriumhypochlorid-Wasser-Gemisch). Beispiel: Reaktor Bruttofüllmenge 14L (14L x 2ml = 28ml Natriumthiosulfat-Lauge). Zitronen- oder Essigsäure lässt sich hier auch einsetzen. Jedoch ist da eine genaue Dosierung sowie Sterilität nicht immer gewährleistet. Im Zweifel setzt man etwas mehr Essig oder Zitronensäure ein, als zu wenig. 
  • Zuletzt sollte man das Gefäß gut mit sterilem Wasser ausspülen oder mit einem leicht alkoholgetränkten (Isopropylalkohol min. 70%), fusselfreien Tuch trocken gewischt werden. Achten Sie bei Acryl- und Plexiglas darauf, dass es nicht zu Oberflächenspannungen und somit zu Rissen kommt. 

Salzwasser (Kulturmedium) sterilisieren

Die wohl einfachste Methode an steriles Wasser zu kommen, ist der Kauf von destilliertem Wasser (5L-Kanister) aus dem Supermarkt. Destilliertes Wasser ist zwar keimfrei aber bleibt das meist nur bis zum Aufsalzen der Fall, da durch den Kontakt mit normaler Raumluft erneut Bakterien und ggf. Fremdalgen in die Kultur gelangen. Zudem ist das einfache Aquariensalz für die Meerwasseraquaristik nie gänzlich frei von Bakterien.

Aus diesem Grund kommt man nach dem Aufsalzen an der Desinfektion des Kulturmediums nicht vorbei. Hier gibt es viele Unterschiedliche Methoden, mit mehr oder weniger Erfolgsaussichten. Einige wollen wir Ihnen hier aufzeigen. Die Reihenfolge basiert auf dem Zuverlässigkeitsgrad der jeweiligen Methode. D.h. auf Platz 1 finden Sie die zuverlässigste und auf Platz 3 eine nicht mehr ganz so zuverlässige Methode.

  1. Autoklavieren (prof. Autoklaven nehmen hier auch große Mengen an)
    Beim Autoklavieren wird ein Glasbehälter mit dem zu autoklavierenden Wasser befüllt, locker mit einer doppelten Schicht Alufolie verschlossen (einfach an den Rändern andrücken, sodass das Wasser aus dem inneren des Gefäßes nicht großartig entweichen kann) und ca. 30 - 90 Minuten unter Druck und mithilfe von Hitze, keimfrei gemacht. 
    Profis nutzen hier spezielle Autoklaven, bei denen man die Temperatur und auch den Druck, überwachen und regulieren kann. Alternativ lassen sich aber auch einfache Dampfdruckkochtöpfe nutzen. Diese befüllt man zu ca. 1/4 mit normalem Wasser, verschließt den Kochtopf sehr sorgfältig und stellt den Herd auf volle Stufe. Sobald sich der Druck im inneren vollständig aufgebaut hat (man erkennt das an einem sehr hohen Pfeifgeräusch des Kessels), stellt man einen Timer auf mindestens 30 Minuten - wirklich sicher sind hingegen 90 Minuten (bei empfindlichen Arten wie z.B. Rhodomonas).
    Sobald der Timer abgelaufen ist, schiebt man den Kessel ganz vorsichtig auf eine andere, kühle Herdplatte und lässt diesen ca. 1 Stunde auskühlen. Erst danach öffnet man den Deckel des Kochtopfs aber ACHTUNG, das Gefäß im inneren ist immer noch kochend heiß also bloß nicht mit bloßen Fingern hinein greifen.

  2. Mikrowelle (bloß für kleinere Mengen ratsam)
    Aufgrund der Größe der meisten handelsüblichen Mikrowellen, passen hier meist nur kleinere Gefäße aus Glas wie. z.B. Marmeladengläser/Trinkgläser oder oder Spezialgefäße für die Mikrowelle wie z.B. Tupper. Die Mikrowelle wird auf höchster Stufe so lange laufen gelassen, bis das Wasser im inneren der Mikrowelle anfängt zu kochen. Nach 60 Sekunden kann die Mikrowelle dann ausgeschaltet und das Wasser im inneren der Mikrowelle stehen gelassen werden, um es langsam abkühlen zu lassen. Sobald man die Mikrowelle öffnet, sollten die Gefäße so schnell wie möglich mit einem sterilen Deckel abgedeckt und geschützt werden. Sobald das Wasser auf Raumtemperatur ist, sollte es dem Reaktor zugeführt oder im Kühlschrank eingelagert werden.

  3. UVC-Lampen
    UVC-Lampen töten leider nicht alle Keime ab und eignen sich deswegen nur bedingt zur Desinfizierung. Sie sind jedoch sehr wirksam im abtöten von Cyanobakterien, welche zwischendurch andere Kulturen befallen und diese langsam verdrängen.